あひる日記

工学系大学院生の備忘録

【論文紹介メモ】イガイのDOPA含有タンパク質と海中のFe3+との複合化過程の考察

論文紹介

イガイおけるDOPA含有タンパク質とFe3+との複合化が，接着機構にどう関わっているか考察した．

  • 今日は，”Switch of Surface Adhesion to Cohesion by Dopa-Fe3+ Complexation, in Response to Microenvironment at the Mussel Plaque/Substrate Interface（ムール貝プラーク/基質界面の微小環境に対応したドーパ-鉄3+錯体による表面付着から凝集へのスイッチング）”という論文を紹介します．（論文サイトへのlink→リンク）

    • Yang, B., et al. (2016). Chemistry of Materials, 28(21), 7982-7989.

  • これは韓国の Pohang University of Science and Technology の Cha, Hyung Joonのグループによる研究である．

    • Professor Hyung Joon Cha, of the Pohang University of Science and Technology’s (POSTECH) Department of Chemical Engineering

    • https://www.asianscientist.com/scientist/cha-hyung-joon/

      Cha, who developed a protein-based adhesive inspired by mussels, received the Inventor of the Year Award  from the Korean Intellectual Property Office. Unlike commonly used medical adhesives, the mussel-inspired bioadhesive is biocompatible and strongly adhesive even when wet. Cha has been listed as the inventor of 135 intellectual properties, including 23 international patents, 47 domestic patents, 34 international patent applications and 31 domestic patent applications.

    • 高 DOPA 濃度のタンパク質：In Vivo Residue-Specific Dopa-Incorporated Engineered Mussel Bioglue with Enhanced Adhesion and Water Resistance (2014)
    • 組織接着剤LAMBA：Rapidly light-activated surgical protein glue inspired by mussel adhesion and insect structural crosslinking (2015)
    • ドーパとリジンの相乗効果：The position of lysine controls the catechol-mediated surface adhesion and cohesion in underwater mussel adhesion (2020)

背景　　ドーパ-鉄3+の錯形成は、イガイの接着化学における重要な相互作用の1つである．tris-錯体は非常に高い結合定数と安定性を持ち，硬さ，伸展性，自己修復性を付与している．ドーパ-鉄3+の複合化はタンパク質の配列や長さに大きく影響される．

目的　　界面イガイ接着タンパク質（MAP）であるdrfp-3F(DOPA ∼17 mol %，6.8kDa) と drfp-5(DOPA ∼23 mol %) の Dopa-Fe3+ 複合体を同定し，Dopa-Fe3+ 複合体が水中凝集力と表面接着力に与える影響を，表面力装置 (SFA) を用いて，凝集力と表面接着力の相互作用を測定することにより検討した．

方法       先行研究に倣い，rfp-3F およびrfp-5は大腸菌から生産した．定常期（チロシンの枯渇）を確認後，培地中にドーパを1mMの濃度で添加し，イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）の添加によりdrfp-3Fの発現を誘導した．drfp-3Fまたはdrfp-5に10mM酢酸（pH〜3）または0.1Mトリス緩衝液（pH8.0）、1mM FeCl3（ドーパ：鉄3+モル比3：1）を添加して試料を調整した．

結果①       ドーパ-鉄3+錯体は，ドーパが化学量論的にmono-，bis-，tris-ドーパ-鉄3+錯体を形成するため，pHに応じた色の変化で簡単に確認することができる．fp-3F 溶液に FeCl3 を Dopa:Fe3+ モル比 3:1 まで添加すると透明なタンパク質溶液が紫/青に変化，NaOHでpHを上げるとタンパク質溶液はピンク/赤に変化，酢酸でpHを下げるとタンパク質溶液は紫/青に戻るがDOPAが酸化されるため完全な可逆性はない．これはUV-visおよびラマンでfp-5においても確認された．

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結果②       凝集力をSFAで測定した．0.1M酢酸（pH∼3）中にFe3+を含む条件で，drfp-3Fは弱い凝集性相互作用を示した（W = 0.507 ± 0.472 mJ m-2）．Fe3+を含む0.1M Tris buffer（pH8.0）は，イガイの足糸が海水にさらされたときに満たす同様の条件である．この条件下で非常に強い凝集性相互作用力（W = 2.126 ± 0.396 mJ m-2）が測定された． Fe3+ を含まない 0.1 M Tris buffer (pH 8.0) の条件では，drfp-3F は弱い凝集性相互作用力 (W = 0.050 ± 0.015 mJ m-2) を示した．この結果は，高pHにおけるdrfp-3FのFe3+との強い凝集力は，O2/baseによる酸化ではなくDopa-Fe3+の錯形成に由来するという説を支持している．

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結果③       表面接着力をSFAで測定した．pH3.0ではFe3+の有無に関わらず接着力は良好であったが（W = 14.728 ± 3.878 mJ m-2），pH8.0でFe3+添加の場合，drfp-3Fの接着力は劇的に減少し，非常に弱い接着力を示した（W = 1.160 ± 0.339 mJ m-2）．静電的相互作用が弱い，塩置換が弱い，高pHで正電荷が減少して凝集する傾向があるだけでなく，bis-およびtris-ドーパ-鉄3+複合化後に表面付着に利用できるドーパが限られていることがdrfp-3F表面付着力を大きく失わせた可能性を示唆している．

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結果④       rfp-3F(DOPAなし)とdrfp-3F(DOPAあり)の接着・凝集相互作用をSFAで測定した．足糸界面MAPはドーパを多く含むため，低pHでは表面接着力が強く，高pHではドーパ-鉄3+の複合体形成により凝集力が強くなることがわかった．イガイからの分泌時には低pH環境でMAPが分泌され強く接着，その後海水中の高いpHとFe3+含有量によりドーパ-Fe3+の錯形成が起こり，MAP間の強い凝集が誘導される．

結論       drfp-3Fの表面接着性とDopa-Fe3+の複合化の関係を分析した．これはプラーク/基板界面におけるイガイの接着機構を理解するのに役立つ．Dopa-Fe3+錯体化の応用は，機械的特性を改善するための良い戦略と思われるが，接着剤への処方としては慎重に使用する必要がある．ドーパを多く含むと表面接着と凝集の両方の能力が高まるが，同時に高まるわけではない．Dopa-Fe3+の錯形成による表面接着から凝集への移行は，可逆性を除いて，酸化剤によるDopa酸化の制御と非常によく似ている．

意見       酸化によるDOPA系接着剤の強化について気になった．今回の錯体による表面接着から凝集への移行は，可逆性をもつとのことだったが，DOPAが酸化されるため完全な可逆性はないとのことだった．酸化を防止した状態で利用できないものだろうか．また，この可逆性はMPN(Metal-Polyphenol Networks)と同様の機構である．

  • 表面力装置(Surface Forces Apparatus,SFA)について
  • DOPAを多く含むと接着力は高くなるのか
    • 表面接着と凝集の両方の能力が高まるが，同時に高まるわけではない
    • fp-3Fでも20 mol%ほどである．
      • These proteins were chosen because of their high Dopa content (∼17 mol % for dr fp-3F and ∼23 mol % for dr fp-5), which are close to the Dopa content of natural fp-3F (∼20 mol %) and fp-5 (∼25 mol %) and facile acquisition, compared to the extremely difficult direct extraction from mussels.
    • fp-3Fは比較的柔軟性があり，そのドーパ残基は表面付着のための基質と凝集のための他のドーパ残基の両方へのアクセスが良好であると思われる．
  • 酸化によるDOPA系接着剤の強化